Western blot

Western blot, WB, även immunoblot, är en vanlig molekylärbiologisk metod som används inom proteinkemin för att detektera och identifiera specifika proteiner med hjälp av antikroppar. Western blot används i princip vid alla laboratorier som bedriver biomedicinsk och biomolekylär forskning, men även vid klinisk medicinsk diagnostik i vissa sammanhang. Termen är bildad i analogi med Southern blot, som är en liknande metod för att detektera DNA.

Tillvägagångssätt

Det första steget vid en WB-analys är att rena fram proteininnehållet från de celler eller vävnader som ska studeras. För att separera proteinerna från cellernas andra beståndsdelar måste celler och vävnader behandlas innan analys. Vävnadsprover kan brytas ner i en homogenisator eller med ultrasonikering. Celler kan behandlas på samma sätt som vävnader eller lyseras. Lysering av celler sker genom att cellmembranet löses upp med en detergent. Det erhållna lysatet centrifugeras för att separera proteinerna från lipider, cellkärnor och andra cellstrukturer.

Proteinerna i lysatet separeras därefter med SDS-PAGE, en metod som separerar proteiner med avseende på molekylmassa som för proteiner mäts i Dalton (anges oftast med prefixet kilo, kDa). SDS binder och denaturerar proteiner, samt gör dem negativt laddade. Proteinerna får vandra i ett elektriskt fält genom en polyakrylamidgel, där de separerar.